荧光免疫层析技术原理荧光标记物种类及技

荧光免疫层析技术是基于抗原抗体特异性免疫反应的新型膜检测技术。该技术以固定有检测线(包被抗体或包被抗原)和质控线(抗抗体)的条状纤维层析材料为固定相，测试液为流动相，荧光标记抗体或抗原固定于连接垫，通过毛细管作用使待分析物在层析条上移动。对于带有多个抗原决定簇的大分子抗原(蛋白、病毒、致病菌等)，通常采用“三明治”型双抗夹心免疫层析方法，即待测物在流动相作用下先与荧光标记抗体结合，当到达检测线时再与包被抗体结合形成双抗夹心的“三明治”型。

免疫层析技术

免疫层析技术(ICA)是20世纪末发展起来的结合免疫技术和色谱层析技术的一种分析方法，该方法具有特异性、操作简单、快速等特点，广泛应用于临床诊断、环境监测、食品安全等重要领域。传统免疫层析技术以胶体金为标记物，通过条带显色对目标物定性检测或半定量分析。该方法虽然简单快速，但灵敏度较差，难以准确定量。荧光免疫层析技术作为一项新型免疫检测技术，既保留了传统胶体金试纸条的现场快速检测优点，又加入了荧光检测技术的高灵敏度特点，成为提高免疫层析方法检测性能的主要途径之一。

荧光免疫层析技术

荧光免疫层析技术是基于抗原抗体特异性免疫反应的新型膜检测技术。该技术以固定有检测线(包被抗体或包被抗原)和质控线(抗抗体)的条状纤维层析材料为固定相，测试液为流动相，荧光标记抗体或抗原固定于连接垫，通过毛细管作用使待分析物在层析条上移动。对于带有多个抗原决定簇的大分子抗原(蛋白、病毒、致病菌等)，通常采用“三明治”型双抗夹心免疫层析方法，即待测物在流动相作用下先与荧光标记抗体结合，当到达检测线时再与包被抗体结合形成双抗夹心的“三明治”型。对于只具有单一抗原表位的小分子抗原(农兽药、违禁药物等)，待测小分子抗原与荧光标记抗体结合后，由于空间位阻作用难以再与检测线上的包被抗体结合。所以，具有单一抗原表位的小分子待测物多采用竞争免疫层析法检测。

荧光标记物种类及荧光免疫层析技术应用

荧光免疫层析分析方法具有灵敏度高、稳定性好、受自然荧光干扰低等优点，成为食品质量安全快速检测分析研究的热点。用于荧光免疫分析的标记物主要包括荧光素、量子点、上转换纳米粒子等。

荧光素免疫荧光层析技术

荧光素是指具有荧光特性的有机染料。年Coons等首次报道了异氰酸荧光素标记抗体用于检测鼠组织切片中肺炎球菌抗原分布的研究，由此出了免疫荧光技术。后来，为了改进异氰酸荧光素的性能，Ruggas等合成了性质稳走、毒性较低的异硫氰酸荧光素。自Marshall等改良了荧光抗体标记技术后，荧光免疫技术得到快速发展。应用于荧光免疫分析的荧光素主要有5种：异硫氰酸荧光素、四乙烯基罗丹明、四甲基异硫氰酸罗丹明、与酶作用后产生荧光的物质和镧系。

宋春美等采用异硫氰酸灸光素作为标记材料标记莱克多巴胺单克隆抗体，应用免疫层析技术研制莱克名巴胺荧光检测试纸条并对其灵敏度、特异性、重复性进行了测定。研究结果表明，该免疫层析试纸条的检测限为1μg/L，较同一抗体的胶体金试纸条的敏感性提高了10倍；与结构类似物物交叉反应结果显示：该方法具有良好的特异性；以不同批次的检测试纸对牛奶等样品中莱克多巴胶残留进行检测，结果一致性较高，重现性良好。

荧光材料在免疫层析技术中的应用显著提高了该方法的检测性能。然而，有机染料标记物光照下易分解，易发生光漂白现象，具有浓度猝灭特征，影响了分析结果的准确性和可靠性。将荧光素包裹于聚苯乙烯微球是提高荧光素分析性能的有效方法。

量子点免疫层析技术

量子点(QuantumDots，QDs)是一种半导体荧光纳米颗粒，直径通常在1-20nm之间，一般由II-VI或III-V族元素组成。与有机染料荧光标记材料相比，量子点具有斯托克斯位移大，激发光谱宽、发射光谱窄，荧光发射强度强而稳定，量子产率高，耐光漂白，成为分析检测领域研究的新热点。

白亚龙以红色CdTe量子点为代表，通过免疫层析法探讨了量子点与小鼠1gG抗体的最佳偶联方式，结果显示以1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(CEDC)与N-羟基琥珀酰亚胺（NHS)的混合物(质量比3：4)为偶联剂制备的荧光探针性能优于直接偶联和以DEC和NHS单独作为偶联剂偶联的到的荧光探针；采用硅烷偶联试剂APTES氨基化的二氧化硅纳米粒子(50-nm)为载体，通过偶联试剂EDC与NHS将其与CdTe量子点偶联，制备得到了高强度的荧光微球；初步研究结果表明荧光免疫层析方法的灵敏度比胶体金免疫层析体系高4-20倍。

上转换纳米粒子免疫层析技术

上转换发光是指反-斯托克斯发光，即用低能量的红外或近红外光激发发射出高能量的紫外或可见光。上转换发光大都发生在掺杂稀土离子的化合物中，NaYF4是上转换发光效率最高的基质材料。与荧光染料、量子点相比，上转换纳米粒子毒性低，灵敏度高，稳定性好，可避免由于样品中具有荧光特性基质对检测结果的影响，是理想的荧光标记物之一。

王浩然等基于上转换免疫荧光单靶标检测试纸，成功研制出对乙型副伤寒沙门氏菌、霍乱弧菌O1和群、大肠杆菌O，甲型副伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌等10种食源性致病菌具有现场检测能力的十通道试纸盘检测系统，可满足食品样品增菌检测和腹泻样本直接检测的灵敏度要求。刘晓等,以上转换发光材料为标记物，建立了可对奶制品中黄曲霉毒素M1进行现场快速检测的上转换荧光免疫层析快速定量检测方法。最优条件下，该方法对奶粉和牛奶中黄曲霉毒素M1的检测灵敏度分别达到0.1ng/mL和0.3ng/mL，每个浓度重复测量的变异系数小于15%。该研究构建的上转换荧光免疫层析试纸条检测方法操作简便快捷、样品前处理简单、具有良好的检测敏感性和特异性，对实际样品的耐受性较好，可满足食品安全中对现场快速检测的需求。

Liu等以核壳型NaGdF4：Yb纳米颗粒与头孢氨芐抗体偶联作为荧光探针，喷涂于结合垫，以头孢氨芐-牛血清白蛋白偶联物和羊抗鼠抗抗体分别喷涂于硝酸纤维素膜上作为检测线和质控线。最优条件下，建立的上转换荧光免疫层析方法的目测检测线为10ng/mL，定量检测的线性范围为0.5-ng/mL[4]。

来源：体外诊断POCT论坛

转载请注明：http://www.holkv.com/ways/10789.html